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技術(shù)文章

液相色譜法測(cè)定維生素A、維生素D3(VA和VD3)

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維生素AVA)、維生素D3VD3)、維生素EVE)和β-胡蘿卜素是維持人體正常生理活動(dòng)和機(jī)能的脂溶性維生素,缺乏這些維生素會(huì)導(dǎo)致多種疾病。流行病學(xué)研究資料表明,脂溶性維生素與癌癥發(fā)生有著相應(yīng)的關(guān)系

  食道癌是世界八大癌癥之一,而我國(guó)又是食管癌的高發(fā)地區(qū),每年因食管癌死亡者約15萬(wàn)人,但有關(guān)食道癌與脂溶性維生素的關(guān)系尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。通過(guò)測(cè)定和比較食道癌病人和正常人血清中脂溶性維生素的含量,可以了解食道癌與脂溶性維生素的關(guān)系,為指導(dǎo)病人正確地補(bǔ)充維生素

提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。目前我國(guó)尚無(wú)測(cè)定血清中脂溶性維生素的標(biāo)準(zhǔn)方法。

HPLC因其具有高分離效能、靈敏快速、可自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)廣泛用于食品等樣品中脂溶性維生素的測(cè)定,而同時(shí)測(cè)定人血清中VA、VD3、VEβ-胡蘿卜素四種脂溶性維生素的報(bào)道甚少。因此,本課題組擬建立HPLC同時(shí)測(cè)定VA、VD3、VEβ-胡蘿卜素的方法,并應(yīng)用于食道癌病人和正常人血清樣品的測(cè)定,為研究食道癌的發(fā)生與血清中脂溶性維生素之間的關(guān)系提供簡(jiǎn)單可行的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和數(shù)據(jù)。

材料與方法

1.1 儀器與試劑液相色譜儀附紫外檢測(cè)器、吹氮儀、視黃醇、維生素D3、α-生育酚和β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品  1mg/ml

維生素標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制:分別精密稱(chēng)取視黃醇、VD3、α-生育酚、β-胡蘿卜素各0.025g25ml容量瓶中,視黃醇、VD3α-生育酚用甲醇,β-胡蘿卜素用二氯甲烷溶解并定容到刻度,搖勻備用。

1.2 

實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 

色譜條件   色譜柱:C18柱;柱溫25℃;流動(dòng)相:甲醇:二氯甲烷:乙腈10:20:70流動(dòng)相程序:

0~12min  流速1.0~1.5ml/min  線(xiàn)性變化,12min~17min  保持流速 1.5ml/min,17min

流速回到1.0ml/min;檢測(cè) 波長(zhǎng)切換程序:0~6min324nm6min~8 min263nm,8~12min291nm,12min后為462nm; 1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制分別取適量維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用流動(dòng)相稀釋成濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)系列,10μl進(jìn)樣測(cè)定,以維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

1.2.3 樣品測(cè)定0.2ml血清中加入0.2ml無(wú)水乙醇沉淀蛋白質(zhì),0.8ml已/石油醚混合溶液提取,振搖1min15000r/min離心2min;取上清液0.6ml,氮?dú)獯蹈桑?/span>0.10ml流動(dòng)相溶解殘?jiān)?,漩渦振蕩器振蕩30s,15000r/min離心2min,取25μl上清液進(jìn)樣測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)和樣品色譜圖如圖1

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